NANOCELL

Nanosensori ottici all’interno delle cellule

 

 


FILOSOFIA DELLA PROPOSTA

Negli ultimi anni, le nanoparticelle hanno mostrato la capacità di penetrare la membrana cellulare e anche di entrare nel nucleo delle cellule. Il loro uso per il trasporto intracellulare di sensori e farmaci è una delle nuove frontiere della nanotecnologia applicata alla biomedicina, anche se la loro biocompatibilità rimane ancora una questione aperta.

L'uso di veicolatori per il trasporto di farmaci nelle cellule, difficile da ottenere in condizioni normali, è una strategia nota, spesso indispensabile, per l'ottenimento del risultato terapeutico desiderato. Una più recente, ma allo stesso tempo promettente applicazione, è il trasporto di nanosensori ottici capaci di monitorare in tempo reale marker biologici che hanno un valore diagnostico e prognostico per patologie o che indicano il grado di risposta alla terapia. Tramite l’utilizzo di nanostrutture capaci di penetrare la membrana cellulare è possibile trasportare all’interno delle cellule sonde ottiche fluorescenti. Questa peculiarità, offerta solamente dai sensori ottici, ha aperto enormi prospettive per un imaging in vitro ed in vivo in grado di studiare in tempo reale meccanismi e processi cellulari e di valutare la risposta delle stesse cellule ai farmaci ed ha fornito un’ulteriore spinta allo sviluppo di nuove tecniche di microscopia in grado di monitorare il segnale fluorescente proveniente dalle cellule. È importante sottolineare come i sensori submicrometrici abbiano una sensibilità maggiore di quelli micro/macroscopici. Questo aspetto è da attribuire al fatto che sensori nanostrutturati hanno dimensioni confrontabili con quelle delle molecole da determinare. Questi nanosensori usano generalmente fluorofori, opportunamente ancorati alle nanostrutture, la cui fluorescenza è funzione della concentrazione del parametro di interesse. Fino ad oggi, questo tipo di trasporto è stato realizzato principalmente con strutture più o meno complesse, completamente biocompatibili, come liposomi e micelle. Con l'avvento di nuovi materiali nanostrutturati, si stanno aprendo altre affascinanti possibilità nel trasporto intracellulare. Lo sviluppo di metodologie efficienti per la modificazione chimica di queste nanostrutture, ha portato alla preparazione di nanoparticelle funzionalizzate su cui una grande varietà di sonde fluorescenti possono essere chimicamente legate. Le nanostrutture modificate possono attraversare la membrana cellulare sotto condizioni ben controllate e mediante meccanismi appropriati. Questi meccanismi possono essere sia endocitosi-dipendenti che endocitosi-indipendenti. La possibilità di avere un ancoraggio covalente con la nanostruttura e non un semplice adsorbimento o incapsulamento come accade nei liposomi e nelle micelle, è un aspetto che elimina o riduce fortemente la perdita della molecola immobilizzata al di fuori della cellula.

Le nanoparticelle hanno mostrato di avere anche una migliore selettività, rispetto ai liposomi e alle micelle, quando il target è un tessuto tumorale. È stato, infatti, osservato che nanoparticelle circolanti si concentrano spontaneamente nei tumori solidi in virtù del maggiore grado di permeabilità vascolare a livello di questi tessuti.

Nanosensori opportunamente progettati, possono anche svolgere un’azione farmacologica dentro la cellula, fornendo uno strumento di estrema utilità nell’ambito delle strategie moderne di terapia personalizzata. Si può avere, in questo modo, uno strumento che migliori la terapia e ne determini contemporaneamente l’efficacia.

Obiettivo essenziale del progetto è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione in colture cellulari di nuove nanostrutture ottiche che agiscano da carrier di molecole in grado di comportarsi allo stesso tempo come sensori e come farmaci. Le nanostrutture oggetto di studio del presente progetto sono nanoparticelle d'oro, nanoparticelle di PMMA (polimetilmetacrilato) e nanotubi al carbonio. Mentre le prime sono già in uso da alcuni anni, le altre due sono fra le nanostrutture emergenti per il trasporto nelle cellule ed entrambe possono essere una valida alternativa agli altri nanomateriali disponibili (quantum dot, nanoparticelle di vetro).

Tali nanostrutture saranno progettate in modo da trasportare degli oligonucleotidi antisenso (AS-ODN) a DNA, strutturati in modo da comportarsi sia da sensore che da farmaco. Il concetto della tecnologia degli antisenso come farmaci è immediato: l'uso di una sequenza complementare all'RNA messaggero (mRNA), in base alle regole di ibridizzazione di Watson e Crick, può inibire la sua espressione e quindi indurre un blocco nel trasferimento dell'informazione dal DNA alla proteina. La possibilità di usare un antisenso anche come sensore verrà perseguita progettandolo come un faro molecolare (molecular beacon). I fari molecolari (Figura 1) sono sequenze oligonucleotidiche marcate alle due estremità, con un fluoroforo da un lato e un quencher dall'altro, progettate in modo da formare una struttura stem-loop in assenza della sequenza complementare, in cui la emissione di fluorescenza è inibita per la vicinanza del quencher con il fluoroforo. L'ibridizzazione con la sequenza complementare apre il loop separando fisicamente il fluoroforo dal quencher, con conseguente emissione del segnale di fluorescenza in seguito ad eccitazione.

 

 

mol_beacon


Conseguentemente il segnale fluorescente risulta essere direttamente legato all’azione del farmaco. In particolare, in questo progetto l’attenzione sarà focalizzata su antisenso specifici per gli mRNA che codificano per la survivina e per la Bcl-2, due importanti proteine antiapoptotiche che sono sovraespresse in molti tipi di tumore e rappresentano il target di nuove strategie antineoplastiche, basate proprio sull’inibizione dell’espressione e/o attività di queste proteine. In particolare, la Bcl-2 è un gene coinvolto nella regolazione dell’apoptosi cellulare i cui livelli elevati in diversi tipi di tumori contribuiscono alla resistenza di questi alla terapia antitumorale. A motivo di questo ruolo, nel corso degli anni si sono tentate strade diverse per modificarne i livelli di espressione. La terapia antisenso che va a silenziare i geni che codificano per le proteine antiapoptotiche è considerata una buona strategia per combattere il cancro poichè l'aumento della concentrazione di tali proteine è stata, infatti, identificata come causa di chemioresistenza e radioresistenza da parte delle cellule tumorali. In questo ambito, lo sviluppo di nanoparticelle che trasportino antisenso per il silenziamento genico in grado di fornire un segnale fluorescente quando diventano operativi, rappresenta una strategia promettente per comprendere e aumentare l'efficacia della terapia antitumorale. È importante sottolineare che questo approccio consente di avere un ancoraggio covalente con la nanostruttura e non un semplice adsorbimento o incapsulamento, aspetto questo che elimina o riduce fortemente la perdita della molecola immobilizzata al di fuori della cellula. Risulta, infatti, essenziale che il farmaco venga rilasciato solo all'interno della cellula per aumentarne la sua efficacia nell’interazione con l’RNA messaggero. È possibile ottenere questa funzionalità utilizzando opportuni cross-linker che introducono un ponte disolfuro fra la nanoparticella e il farmaco, il quale viene "tagliato" dagli enzimi presenti all'interno delle cellule.